于和伟于1999年参演第一部电视剧《曹操》，从而正式开始自己的演艺生涯。2003年，参演由高希希执导的抗战剧《历史的天空》。2004年，在情感电视剧《搭错车》中饰演苏民生。2009年，在古装剧《三国》中扮演刘备这一角色。2011年，主演电视剧《青盲》。2011年，凭借电视剧《幸福在路上》获得南方盛典最佳男演员奖。2012年5月22日，获得MSN星月年度最具价值男演员奖。2014年，主演凭借都市情感剧《下一站婚姻》荣获第17届华鼎奖当代题材最佳男演员奖。
2015年8月9日，参演《下一站婚姻》，并凭借此剧获得了第17届华鼎奖最佳男演员奖。2017年9月16日，出演电影《我不是潘金莲》获得第31届中国电影金鸡奖最佳男配角。2018年，出演《大军师司马懿之军师联盟》获得第24届上海电视节“白玉兰奖”最佳男配角。2019年，主演电视剧《巡回检察组》；同年，获得第十七届电影表演艺术学会奖。
