下关条约
恰在同时，长州藩遭到了英美法荷四国联合舰队的报复新攻击。联合舰队由英国东洋舰队司令库巴指挥，共有17艘军舰，配备有288门大炮和5019名士兵，还有3艘联络船。9月5日，舰队开始攻击下关，猛轰了三天，摧毁了全部炮台。长州军队虽然顽强战斗，但终因实力悬殊而失败。这一事件，是“长州政策上的，甚至日本历史上的一个转折点”。9日，长州藩主派高杉晋作化名宋户刑马家老充任讲和使者，前往联合舰队与库巴签定了放弃攘夷的“下关条约”。
第一次征长战役
8月24日，幕府为了追究长州兵在“禁门之变”中进攻京都皇宫的责任，取得讨伐长州藩的敕令，便通知各藩出兵。讨伐军由御三家之一尾张藩主德川庆胜率领，共计6藩15万兵力准备讨伐长州。然而各藩苦于财政困难，对幕府恢复参觐交代制怀抱反感，因而并无战意，军队行动迟缓。讨伐军参谋、萨摩藩士西乡隆盛提出了假长州人之手处分长州机进派这种妥协方案作为解决办法。12月9日，长州藩保守派将三名攘夷派家老切腹以示“恭顺投降”。第一次征长战役就这样结束了。
长州藩在内外攻击下屈服于幕府，保守派掌握了藩政，并下令解散诸队和惩处尊攘派志士，使长州藩刚刚形成的尊攘势力受到严重打击。晋作为躲避迫害，遂化名谷梅之助从家里潜行至九州筑前藩的维新女士野村望东尼的平尾山庄隐蔽。长州藩倒幕势力在艰难困苦的环境中不仅没有解散，反而团结内部，加强军事训练，准备同幕府进行最后的决战。
以武力夺取藩政权
正当长州藩倒幕势力力量处于困难之机，亡命于筑前的高杉晋作决心以武力夺取藩政权，并与幕府斗争到底。于是，他潜回下关，秘密联络诸队布置起兵。1865年1月14日，晋作在下关功山寺举兵。他列举藩内保守派间吏的罪恶，呼吁人民群众为国诚心协力，挽救国难。下关举兵受到豪农豪商的热烈支持，他们组织了“庄屋同盟”，发誓要组织农民起义，并给予大量财力物力上的帮助。1月28日，晋作动员伊藤博文的力士队迅速攻占了下关伊崎会所，夺取了大量军费和武器弹要。2月1日，晋作发表“讨间檄”，率部与保守派军队决战于绘堂，一举夺取了藩政权。
继续实施“富国强兵”政策
倒幕派掌权后，晋作曾准备出国考察西方富国强兵的经验，但长崎的英国军火商古拉伯劝他此时不宜出国，应该留下倡导开港，那样长州藩就可以从英国获得大量新式武器，晋作深以为是。高杉晋作指出，应该在不辱国体的条件下开下关港，只有这样才能割据富国。否则，就不仅赶不上幕府和萨摩藩的实力，还会最终陷入外夷妖术。于是，他便留在藩内处理军国大事。从10月到12月，他先后担任了藩内的“用所役国政方”(政务机关的长官)，“海军兴隆用挂”(负责海军建设的官职)，下关“越荷方头人座” (对北陆道所属7个藩国运来的货物进行收购的机构的官员)和下关“伊崎新地都合役”(行政官职)。1867年7月,他又担任过海军提督(司令)。晋作等人在“富国强兵”、“殖产兴业”、“开港贸易”的近代化方针指导下，实行了一系列的政治、经济和军事方面的改革。如破除封建门阀和身份制度，不拘一格选拔人材;改革军事制度，实行军备近代化;大搞开港贸易，发展工业等等，使长州藩作为“割据倒幕”基地而日益巩固和发展。
第二次征长战役
庆应2年(1866年)1月21日(有一说是1月22日)，在土佐藩的坂本龙马、中冈慎太郎、土方久元的仲介下，晋作和桂小五郎、井上闻多、伊藤俊辅(伊藤博文)一起在京都和萨摩藩组成萨长盟约。
5月时，与伊藤俊辅一起被命令前往萨摩，并且在长崎单独买下了新式战舰“丙辰丸”。
1866年6月，在反击幕府发动的第二次征长战役中，晋作身为全藩军事统帅，并兼任海军总督，冒着抢林弹雨乘军舰“丙辰丸”亲自指挥并参加了大岛和小仓反击战，击退幕府舰队，夺回了周防大岛，使长州藩方面取得彻底胜利。在战场上，这位英雄曾吟诗一首：“赫赫东藩八万兵，袭来屯在浪华城，我曹快死果何日，笑待四邻闻炮声。”从诗里可以想象出他当年指挥自若的请景。
当明治维新的胜利曙光依稀在望之时，在樱山疗养的高杉晋作因肺结核于应庆三年4月14日(1867年5月17日)逝世于下关新地，遗命葬在奇兵队驻地吉田，时年不足28岁。未说完的辞世之句为“おもしろき こともなき世を おもしろく”(让这无趣的世界变得有趣吧)
有人认为，“为何如此啊?异常的世间!只因他骑马，反觉马睑圆”这首歌是戏弄高杉的。硬将其容貌和他的历史作用联系在一起，的确耐人寻味。
在明治维新历史长卷中，高杉晋作是一位值得重视的英雄人物。其政治生涯是短暂的，但却有声有SE，威武雄壮，处处是惊涛回澜。在幕末各种政治力量重新组合的过程中，他勤于学习，长于思考，往往未雨绸缪，机智纵横。概观高杉晋作一生，虽有不足，但其思想在不断地向前发展并日趋成熟。其理论和实践始终是与时代变革的脉搏一致的，不愧维新先驱者的称号。
后因木户孝允(桂小五郎)和大村益次郎等人要求，晋作被接入靖国神社与其他革命先驱一同接受表彰和祭拜。
有说晋作曾于1866年作都々逸“三千世界の鸦を杀し、ぬしと朝寝がしてみたい”(三千世界鸦杀尽，与君朝寝到天明)给木户孝允。
伊藤博文在他的彰显碑上写道：“如果要能动如雷电、发如风雨，使众目骇然，无能够正视者。我则比不上东行高杉君”
有人用“仰天大笑出门去，我辈岂是蓬蒿人”来评价他;因为高杉晋作爱酒爱美人，也有人评价他为“醉卧美人膝，醒握天下权”。
