1920年，于载畿出生在北京知识分子家庭，从小父亲就灌输她男女平等的理念。“但是旧社会的女新想自立，一是搞教育，二是当医生。”于载畿说。长大后于载畿姐妹三人先后进入北京大学医学院(北京医学院、北京医科大学前身)就读，毕业后都留校工作，妹妹还成为新中国第一批博士生导师。
实习期间，于载畿师从中国妇产科学的主要开拓者林巧稚。林巧稚被称为“万婴之母”，“林老师规范的医技和高尚的医德对我影响很大。”于载畿回忆，上世纪40年代，日本投降后，以林巧稚为首，曾受英美医学作风影响的一批专家，改变了医院陈旧落后的医学作风，草作更加规范，对待病人也更加ti贴。
