1998年，毕业于上海戏剧学院，毕业后参演了第一部改编自陕西驻沪作家李春平同名小说的电影《玻璃是透明的》，马伊琍饰演“小丫子”，同年出演的第一部古装电影《孔乙己》至今没有公映。
2000年，出演了《黑洞》饰演演三陪女，马伊琍的表演事业得到了更好的提升，在电视剧《前世今生》中饰演美貌且气质超凡的秦婉莹。
2001年，出演电视剧《白天睡觉的女人》饰演李秀，在电影《西施眼》中饰演施雨，该剧在2002年美国夏威夷国际电影节中获评审团大将及亚洲最佳电影。2002年，因出演电视剧《还珠格格Ⅲ之天上人间》中紫薇一角而被大众所熟知。2004年，出演了由黄磊指导的《天一生水》饰演一个混血姑娘明妮。
2005年，出演张黎导演的电视剧《锦衣卫》在剧中就出演了一个这样的倾国美人客印月。
2006年，参演《乔家大院》扮演的“江雪瑛”，2007年，出演由赵宝刚指导的青春励志电视剧《奋斗》而知名度得到进一步的提升。
